液相色谱仪分析方法的开发流程

液相色谱仪分析方法的开发流程

日期:2024-5-28
我们作液相色谱仪分析先要查阅国家标准、行标或企业标准,并以此为依据进行色谱分析。那么,要开发一个液相色谱方法的话,往往是因为原方法分离效果差;或者没人做过,查不到具体方法;再或者是未知化合物的方法开发。我们今天就介绍一下液相色谱的方法开发流程。

我们就以未知化合物为例。

分离模式的选择

我们先测试样品的溶解性:如果在烷烃试剂中溶解性好,那么可首选正相模式开发方法,色谱柱主要以硅胶柱为主,流动相可以选择正己烷-乙醇、二氯甲烷-甲醇;

如果在二氯甲烷或乙醇中溶解性好,那么可以选用正相模式,或者反相模式中的纯有机模式,色谱柱可以用硅胶柱、C18或C8,反相的流动相可以用甲醇-乙腈、乙腈-二氯甲烷;

液相色谱仪分析方法的开发流程

如果在水、甲醇或乙腈中溶解性好,那么可以选用反相模式、Hilic模式或离子交换模式,反相流动相可以用水-甲醇、水-乙腈,HILIC的流动相可以用乙腈-水,离子交换流动相可以用缓冲盐浓度梯度洗脱、或pH的梯度洗脱。

反相流动相pH的选择

如果是分析酸性化合物,我们选择流动相的pH应低于其pKa至少2个pH单位;如果是分析碱性化合物,流动相的pH应高于其pKa至少2个pH单位。

液相色谱仪分析方法的开发流程

检测器的选择

确定待测物结构上是否有紫外强吸收化学键(异戊二烯),可以用DAD检测器看一下紫外吸收强度范围,选取合适的分析波长;如果结构上没有双键,则不能用紫外检测器,可以考虑示差折光检测器(RI);如果待测物沸点较高(大于400℃),则可以选择蒸发光散射检测器(ELSD)或电喷雾检测器(CAD);如果需要确定分子量,可以连接质谱检测器。

液相色谱仪分析方法的开发流程

流动相梯度或等度条件的确定

我们可以先跑一个大梯度,比如反相用水和乙腈流动相,可以用乙腈的比例从5%逐渐增至95%,根据出峰情况,再去优化放缓梯度。

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